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MANEJO ALTERNATIVO DE MYCOSPHAERELLA FIJIENSIS A TRAVÉS DE LA INDUCCIÓN DE RESISTENCIA Y USO DE BIOPRODUCTOS
Resistance induction and bioproducts as alternative management of mycosphaerella fijiensis

1. Resumen
2. Introducción
3. Inductor O "Elicitor"
4. Mecanismos De Defensa
5. Resistencia Sistémica Inducida (Rsi) Y Resistencia Sistémica Adquirida (Rsa)
6. Estudio Del Patosistema: Musa-Mycosphaerella Fijiensis
7. Musa-Mycosphaerella Fijiensis-Vs- Musa-Radopholus Similis
8. Referencias Bibliográficas


 
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1. RESUMEN

Aumentar la producción con el uso de tecnologías limpias con una mínima aplicación de químicos que no afecten el medio ambiente o lo que seria aun más importante, el lograr la erradicación de agroquímicos de los paquetes tecnológicos, es un reto para la comunidad científica bananera. El enfoque de la inducción de resistencia local y sistémica adquirida (SAR) será presentado en forma clara y objetiva desde el punto de vista de la interacción planta-patógeno. Se enfatizara el complejo de señal bioquímica e histológica desde el inductor (la planta activada en cascada por genes trabajando en la transducción de una maquinaria de defensa de la planta) hasta fortalecerá contra la agresión del patógeno o dejarle activa la memoria para que se defienda de posteriores ataques.

Se discutirá la conveniencia o no de utilizar cationes como coadyuvantes de los inductores o activadores de resistencia, se cuestionara el uso de los mecanismos SAR per se para aumentar los rendimientos al generar la acumulación indeseada de ciertos metabólitos secundarios con efecto contrario a lo esperado. El análisis de fertilizantes basándose en fosfitos, la intervención de iones calcio u otros cationes o microelementos será relacionada con rutas del metabolismo secundario que se puedan ver estimuladas en la planta, en beneficio de la inducción de resistencia natural. Esto se relacionara con las proteínas relacionadas con la patogenicidad (PR), cuyos genes serán activados durante todo este proceso.

En cuanto a bioproductos se hará una revisión de aquellos tanto de origen microbiológicos como los botánicos y se explicará la forma como estos actuarían para bloquear, inhibir, antagonizar, en un parasitismo e inducción de resistencia, entre otros. Finalmente, se estudiara un caso mixto de manejo que considera simultáneamente dos patosistemas R.similis-Musa-vs.-M.fijiensis-Musa.

2. INTRODUCCIÓN

En su afán por contrarrestar el ataque de plagas y maximizar la producción, la agricultura moderna es altamente dependiente de insumos y plaguicidas sintéticos. Esto ha traído enormes problemas para la salud animal y humana con un impacto ambiental cada vez creciente. Es una constante, en la gran mayoría de cultivos de importancia económica, el uso de plaguicidas como única estrategia de control de la enfermedad, generando un incremento en las mutaciones de la componente patogénica, otorgándole plasticidad genómica y por consiguiente, mayor resistencia a los agroquímicos comercialmente utilizados.

Lo anterior, ha impulsado la búsqueda de nuevas alternativas para el manejo de enfermedades y plagas agrícolas, basados: (i) en el biocontrol empleando bioproductos de origen vegetal, animal o microbial, explorando el potencial presente en los metabólitos secundarios y (ii) con los avances de la resistencia sistémica inducida o adquirida. En la naturaleza nos encontramos con que las plantas están continuamente expuestas a una amplia gama de microorganismos patogénicos que las pueden atacar, pero estas tienen la capacidad de utilizar varias estrategias de defensa, en función de la constitución genética que posee tanto el hospedero como el patógeno. Bajo esta restricción y atendiendo la hipótesis gen-por-gen expuesta por Flor [1971], algunos mecanismos de resistencia serán específicos para ciertos cultivares y cepas de patógenos, dado que los genes de resistencia (alelo dominante R-) de la planta son receptores de las moléculas especificas del patógeno como resultado de la expresión de sus propios genes de avirulencia (alelo dominante Avr-).




El objetivo de esta presentación es la de analizar, en forma general, los mecanismos de defensa en la interacción planta-patógeno para discutir los avances logrados en el patosistema Mycosphaerella fijiensis-vs- Musa acercarnos a plantear una estrategia alternativa de control para la Sigatoka negra en el cultivo de banano o plátano. Asimismo, hacer un análisis teórico, de dos patosistemas estudiados en conjunto Radopholus similis- Musa-VS-Mycosphaerella fijiensis-Musa.

3. INDUCTOR O "ELICITOR"

En primera instancia, el concepto de inductor (= "elicitor", en ingles) ha sido asignado a moléculas activadoras capaces de inducir la síntesis de fitoalexinas en la planta, en ausencia del patógeno [Albersheim & Valent. 1978, Keen et al. 1972]. En la actualidad, este concepto es ampliamente aplicado a múltiples reacciones de defensa que se inducen y agrupan tanto a nivel histologico de barrera física como bioquímico con la síntesis de novo de proteínas relacionadas con la patogenicidad (=PR, Protein Related). La naturaleza química de estos inductores es muy variada, tales como: ácidos grasos, RNA levaduras, glicoproteínas, proteínas, peptidos, glicolípidos, lípidos, lipoproteínas, lipopolisacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, entre otros. Se pueden encontrar inductores de tipo exógenos y endógenos, dependiendo de como son producidos. En el primer caso, el origen es parasitario o producido por algún agente físico externo, lo que lleva a subclasificar este tipo de inductores en biótico y abiótico, respectivamente. Cuando se menciona al inductor endógeno, se le asimila con células liberadas desde la pared celular (contiene 90% de polisacáridos: celulosa, hemicelulosa y/o pectinasa y, un 10% de proteínas) del hospedante como resultado de la interacción primaria con el patógeno y que estos fragmentos liberados, sean los responsables de inducir la señales de defensa en la misma planta.

El empleo de tratamientos, como: hidrólisis ácida parcial, álcalis, calor y degradación enzimática, han sido rutinariamente utilizados para la obtención experimental in vitro de estos inductores bióticos, a partir de la pared de microorganismos patógenos o patógenos inactivos. Cuando la obtención de estos inductores exógenos bióticos es producida in vivo, estos son liberados espontáneamente en los filtrados de cultivo de microorganismos patógenos o no, o pueden ser extraídos de tejido infectado por métodos de infiltración en un tampón que lave los espacios intercelulares donde supuestamente ha estado colonizando el patógeno biotrófico a las células del hospedante [Riveros y Lepoivre, 1998, Waldmüller et al. 1992]. Asimismo, la extracción de exudados radicales en su interacción con nematodos fitopatógenos [Mateille 1994], la extracción de compuestos orgánicos volátiles desde cepas de bacterias promotoras del crecimiento [Ryu et al 2004] y, la liberación volátiles de plantas infestadas por insectos plaga [Arimura et al 2001; Paré & Tumlinson 1999] han sido importantes componentes en el momento de definir que induce la reacción de defensa.

La literatura reporta una amplia gama de inductores exógenos abióticos de naturaleza química, semi-sintéticos no naturales, que han sido utilizados como inductores de resistencia a enfermedades en trabajos de laboratorio, invernadero y/o en campo, algunos de estos se citaran en la resistencia sistémica adquirida [Kuč 2001; revisión Riveros 2001]. En general, los inductores son moléculas de bajo peso molecular, no cuentan con una actividad antimicrobiana, muestran acción de protección local inducida y en otras, se vuelven sistémicos e incluso pueden ser de amplio espectro, protegiendo contra enfermedades causadas por diversos microorganismos (hongos, bacterias, micoplasmas, virus y nematodos, entre otros).

El usuario de estos bioproductos, tiene la falsa esperanza de que este inductor sea el sustituto por excelencia del fungicida, pero, es claro que debe ser visto cuidadosamente como una alternativa adicional dentro de un programa de manejo integrado de plagas para el cultivo dado. Toda vez que esta metodología aplica el principio de “inmunización o vacuna” de plantas, de acción netamente preventiva no curativa, de bajo costo y con buena aproximación biocontroladora, sin causar estragos al medio ambiente.

4. MECANISMOS DE DEFENSA

Los mecanismos de defensa en las plantas, se pueden presentar como respuestas pasivas celular o histológico, por la acumulación de ciertos materiales (lignina, callosa, suberina, gomas, cutina, glicosidos fenólicos, fenoles, quinonas, esteroides, glicoalcaloides, terpenoides y tioninas) al nivel de la pared celular.

Entre los mecanismos de defensa no pasivos se puede mencionar la producción de: fitoalexinas, especies activas de oxigeno "AOS", activación del programa de muerte celular, radicales libres, iones calcio, siliconas y silicatos, polifenoloxidasas, peroxidasas, fenilalanina amonia liasa, polímeros de pared unidos a formas fenólicas, glicoproteinas ricas en glicina o hidroxiprolina, lipooxigenasas, fosfolipasas, proteínas ricas en leucina, proteínas antimicrobiales, ribonucleasas, proteasas, peptidos y otras proteínas relacionadas con la patogenicidad (PR), tales como: las quitinasas y las β-1,3-glucanasas, entre otras.

Las PR, son proteínas que se acumulan en respuesta a la infección, aunque también se les encuentra en forma constitutiva, se localizan tanto en los espacios inter como intracelulares, lo que las hace a veces ser básicas o ácidas, se han encontrado de preferencia almacenadas en las vacuolas [Yun et al 1997]. Inicialmente, en la relación planta-patógeno, se consideran cinco grandes grupos de PR, usando técnicas bioquímicas y moleculares [Bol et al 1990]. En la medida en que se han perfeccionado los métodos de detección aumento la clasificación, ya se reconocen 14 familias de PR y este listado, podría ir en aumento progresivo con el tiempo [van Loon & van Strien 1999].

La activación del programa de muerte celular o reacción hipersensible (RH), es un mecanismo implícito en la inducción de resistencia, como reacción necrótica de defensa rápida y localizada, acompañada de muerte celular.
La RH fue descrita por primera vez por Stakman [1915] ocurriendo únicamente en plantas resistentes. Aun es impreciso si la RH es pre-requisito para que sé de la resistencia o simplemente es la consecuencia de otros mecanismos que limitan al patógeno. Ya se han encontrado casos de plantas interactuando con bacterias, hongos y virus que siendo resistentes, no utilizan la señal de RH y esto cuestiona el papel central y prioritario que siempre se le asigno [Bendahmane et al. 1999]. La respuesta a esta pregunta, muy seguramente, vendrá de manos de técnicas basadas en genética, bioquímica y/o citología [Kombrink & Schmelzer 2001].

5. RESISTENCIA SISTÉMICA INDUCIDA (RSI) Y RESISTENCIA SISTÉMICA ADQUIRIDA (RSA)

La RSI fue descubierta a comienzos del siglo pasado, en 1901, con los ensayos de "inmunización" realizados separadamente por Ray y Beauverie [Beuverie 1901, Ray 1901]. La RSA fue descrita por primera vez por Ross en 1961 en estudios de resistencia inducida al TMV en el tabaco. Ambos RSI y RSA son mecanismos naturales de defensa, considerados términos sinónimos para un importante grupo de investigadores en este campo. No obstante, otros científicos consideran que la RSI ocurre cuando los mecanismos de defensa en la planta son estimulados y actúan para resistir la infección causada por el patógeno. Esta activación de RSI se da por la proximidad de microorganismos estrechamente relacionados o en asocio con el tejido de la planta. Mientras que, en el caso de la RSA en el momento en que se da una infección localizada y la mediación activa de un inductor hace que las células del hospedante enciendan el ciclo de SAM (adenosin-metionina) por una cadena de genes que desencadenan uno ovarios mecanismos de defensa contra ese patógeno en particular o inespecifico, contra otros potenciales agresores. La inducción de RSA produce una señal sistémica, entiéndase la protección espacial de diferentes órganos de la misma planta, en un amplio espectro y duración, donde la HR y varias familias de genes de PR son inducidos como mecanismos asociados, determinantes de la respuesta de defensa [Ryals et al 1996]. La RSA resulta de la aplicación exógena de diferentes sustancias activadoras, tales como: el ácido salicilico (AS) sus derivados y sus análogos funcionales como el BTH, el ácido nicotinico derivado del 2,6-dicloroisonicotinico ácido, el acibenzolar-S-metil comercializado como Actigard™ o BION™, el cual fue el primer químico sintético desarrollado que funciona estrictamente como activador de RSA [Ruess et al 1996]. Uno de los criterios de base según Kessmann y colaboradores (1994) es que estos inductores sintéticos no exhiban in vitro actividad de inhibitoria como metabólitos anti-microbial. La acumulación de metabólitos secundarios indeseables o perjudiciales a altas dosis no permisivas por la planta era uno de los problemas, lo cual se observaba en las pruebas de invernadero y campo, donde se presentaban efectos fitotoxicos indeseables, si se quiere llevar al plano de aplicación comercial. Con el tiempo, este inconveniente ha sido trabajado y solventado con ayuda en la incorporación de cationes (Cu, Mn y Zn) presentes en enmiendas orgánicas o adicionadas externamente en el sustrato. Estos cationes atrapan y reducen los radicales libres de oxigeno que se acumulan durante el desarrollo de la enfermedad, coadyuvan al transporte de iones calcio en el ámbito celular, incrementa la acción de hormonas de crecimiento y la actividad del RNA, entre otras tareas celulares.

6. ESTUDIO DEL PATOSISTEMA: Musa-Mycosphaerella fijiensis

Para ejemplificar este patosistema se utilizaron biopreparados obtenidos desde filtrados de estructuras reproductivas conidiales en germinación de cepas costarricense de M. fijiensis. Los cuales por información previa sabíamos que se encontraba un inductor exógeno allí presente (Riveros 1995). Estos filtrados fueron concentrados 10x con ayuda de rotavapor seguido de liofilización y rotulados como la Fracción cruda de Mf (FCMf). El producto resultante fue utilizado para la realización de pruebas de inducción de resistencia que fueron reconfirmadas sobre los mismos cvs. Gran enano (susceptible) y Yangambi Km 5 (resistente), siguiendo el método de inyección y leyendo la necrosis de tejido y la aposición de productos fluorescentes (callosa) en la membrana celular [Riveros y Lepoivre 1998].

Con el fin de evidenciar, si este mismo bioproducto caracterizado químicamente como bien una glicoproteina o un polisacarido (donde la parte sacarida es encargada de la inducción), podría ser responsable de la inhibición del crecimiento de esporas o de la disminución en el diámetro de colonias de M. fijiensis, se procedió a utilizar la metodología recomendada por CORBANA para estos fines. Se utilizo la FCMf, un control absoluto (agua) y un control relativo el fungicida comercial Tilt, en todos los casos las concentraciones usadas fueron: 0,01; 0,1 y 0,5 ppm. Los resultados nos muestran que la FCMf a concentraciones de 0,5 ppm presenta un porcentaje de inhibición tanto en ascosporas en la descarga como en el crecimiento de diámetro de colonias [Riveros et al. 2003]. El biofungicida FCMf luego de ser liofilizado presenta las siguientes características: polvo grisáceo verdoso fino, soluble en agua, con un pH 7, un peso seco entre 93-95% y una lectura de sólidos totales alrededor de 2x10-2.

Los resultados, cuestionan el papel de un inductor, el cual no puede verse implicado en el rol de metabólito secundario o molécula inhibitoria in vitro, como lo menciona Kessmann et al [1994] por lo menos para los inductores de RSA. Los cortes histologicos ayudaran a visualizar en forma comparativa con el control agua, cuales han sido las modificaciones celulares mas sobresalientes sucedidas al crecimiento hifal durante la exposición al FCMf.

Los datos acerca del inductor exógeno, estudios de purificación parcial de la FCMf, la caracterización química efectuada y las pruebas biológicas tanto en invernadero sobre plantas como bajo condiciones in vitro sobre M. fijiensis, nos permite concluir que estamos frente a un fungicida tipo biológico. En un futuro cercano, seria importante diseñar protocolos dirigidos a la obtención masiva o semicomercial del biofungicida a partir de la cepa de Mycosphaerella fijiensis que produzca la mayor cantidad de ingrediente activo y no biomasa micelial. Se deberá caracterizar cuales serian los componentes mayoritarios de metabolismo secundario involucrados en el ingrediente activo del biofungicida, realizarle tanto las pruebas toxicologicas como las de inocuidad a los alimentos y medio ambiente. En los ensayos biológicos de campo incluir como controles el fungicida comercial sistémico y el protectante para efectos de recomendaciones posteriores, si como las pruebas con diferentes adherentes.

De otro lado, se retomaran algunos datos puntuales de la presentación de Polanco et al (2004), también, presentada en este evento Internacional, para enfatizar el impacto de los metabólitos secundarios y otros mensajes secundarios (etileno, ácido Jasmonico, AS, iones calcio, entre otros) en los mecanismos de defensa de la planta.

7. Musa-Mycosphaerella fijiensis-VS- Musa-Radopholus similis

Aún no se menciona, ni siquiera por equivocación, ni en la literatura ni en foros científicos de fitopatología o control biológico de plagas, la posibilidad del análisis simultaneo de lo que hace un patógeno en el ámbito foliar estudiado en conjunto con el daño causado por una plaga a nivel radicular.

Pues bien, la inducción de resistencia nos da muchas herramientas científicas, para imaginar un escenario donde hongos de suelo no patogénicos, que conocemos como hongos endofíticos, puedan proteger la semilla que vamos a plantar en campo y, estas plantas una vez desarrolladas, puedan crecer vigorosas y protegidas contra un amplio espectro de patógenos y plagas. Lo que significa una protección iniciada a nivel de suelo para contrarrestar los nematodos y que se extienda con el tiempo a nivel foliar, como en el caso del control de la Sigatoka negra causada por M. fijiensis. Además, la incorporación dentro de la protección foliar como estrategia amplificadora de señal, de un fungicida de origen botánico, podría complementar el papel como inductor exógeno que refuerza o amplifica la señal de protección local o translocando vía floema a xilema en vertical de descenso, a reforzar la defensa en zona radicular.

En esta parte final, se presentaran diagramas hipotéticos, que ilustran cómo la planta se protege y podría estar expuesta a un manejo de señal vertical (arriba-abajo) bipolar, donde intervendrían mensajeros secundarios, para lograr una inducción de mecanismos de defensa al ataque de nematodos (R. similis) y reducir la incidencia y severidad de la Sigatoka negra (M. fijiensis).

8 . REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Riveros AS, 
Investigador Asociado.
Unidad de Fitoprotección, Centro Agronomico Tropical de Investigacion y Ensenanza 
“CATIE” Convenio UTolima-CATIE. Turrialba, Costa Rica. 
FE Rosales 
Coordinador Regional y Asesor científico.
Red Internacional para el Mejoramiento Genetico de Banano y Plantano
“INIBAP” c/o CATIE”. Turrialba, Costa Rica.

LE Pocasangre 
Coordinador Regional y Asesor científico.

Red Internacional para el Mejoramiento Genetico de Banano y Plantano
“INIBAP” c/o CATIE”. Turrialba, Costa Rica.


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