Estudio de la capacidad antioxidante del champiñón y setas de La Rioja en micelio, cuerpos fructíferos y SPCH

Se estima que el Reino Fungi consiste en 1,5 millones de especies de las cuales solo se han descrito 70.000, de ellas 650 tienen propiedades farmacológicas. Dentro de este amplio grupo sobresalen los basidiomicetos, con prometedores actividades biológicas, debido a una extensa gama de metabolitos que actúan como sustancias inmunomoduladoras, antitumorales, antivirales, antimicrobianos, etc. Esto es debido a su enorme cantidad de moléculas con actividades biológicas tanto en micelio como cuerpo fructífero.

Los hongos están siendo evaluados cada vez más en Occidente por su valor nutricional y también por sus propiedades farmacológicas. Poco a poco están comenzando a verse como alimentos funcionales y como fuente de medicinas fisiológicamente beneficiosas y no invasivas, mientras que otros hongos que no son comestibles están considerados como una fuente de componentes medicinalmente beneficiosos. De modo que, los hongos no sólo se utilizan por sus buenas cualidades de sabor y textura, sino que además son una importante fuente de compuestos bioactivos.

Durante la última década, la palabra antioxidante ha adquirido importancia en la salud preventiva, estos pueden jugar un papel importante en enfermedades degenerativas como Alzheimer, artritis, cáncer, diabetes, cardiovasculares, etc. Las sustancias oxidantes pueden actuar sobre cualquier molécula, especialmente sensibles resultan los ácidos nucleicos, las proteínas y los fosfolípidos presentes en todas las membranas de las células. La interacción de los oxidantes con estas moléculas produce en ellas una modificación estructural que provoca una alteración funcional. Estos se denominan radicales libres, los cuales poseen una capacidad de reacción muy elevada, son capaces de actuar en sistemas biológicos produciendo cambios en la composición química o en la estructura de las células. Existen evidencias que los radicales libres son subproductos del metabolismo y también se pueden formar por exposición a radiación, humo del tabaco, ciertos contaminantes disolventes orgánicos, pesticidas e incluso el ejercicio intenso. Por consiguiente, el papel de los antioxidantes como neutralizadores de los radicales libres, pueden ser de vital importancia en la prevención de ciertas enfermedades.

Algunos de los compuestos bioactivos que poseen los hongos actúan como agentes antioxidantes. En el Centro Tecnológico de Investigación del Champiñón de La Rioja (CTICH) llevamos años estudiando las propiedades beneficiosas de los hongos. Gracias al proyecto BIOTEC se ha podido estudiar la capacidad antioxidante de los cuerpos fructíferos, subproductos y de sus sustratos post-cultivo. El objetivo de este proyecto es triple. Por un lado, conocer la capacidad antioxidante de los hongos/micelio que se cultivan en nuestro centro, ya que las materias primas utilizadas en la fabricación de sustratos y el manejo en el cultivo pueden suponer grandes diferencias en las características bioactivas propias de los hongos cultivados. Segundo, la industria de los hongos genera gran cantidad de subproductos que son desechados por carecer de un uso posterior, en este caso los llamados culillos; se quiere conocer, si estas partes del hongo poseen capacidad antioxidante para poder ser reutilizados y aprovechados para extraer sustancias bioactivas antioxidantes. Y por último, el cultivo de hongos genera anualmente un elevado volumen de sustrato post-cultivo (SPCH) que debe ser gestionado en centros de recogida y que constituye una materia prima con alta capacidad de revalorización. De los usos que se han descrito hasta ahora destacan el empleo en biorremediación, enmienda general de suelos, alimentación animal y acuicultura, control de plagas y enfermedades y usos como combustible, etc. en el presente proyecto se quiere estudiar la presencia de sustancias bioactivas con capacidad antioxidante que pudieran ayudar a revalorizarlo.

Tras la finalización de este primer año se han desarrollado etanólicos al 80% de las matrices de interés de las especies Agaricus bisporus y Agaricus brunnescens.

Figura 1. Especies estudiadas en proyecto BIOTEC

Los métodos analíticos utilizados para determinar los niveles de antioxidantes dependen de los tipos de compuestos de interés. Los antioxidantes pueden ser analizados ya sea como un grupo funcional, grupos de antioxidantes o como antioxidantes individuales. Se han cuantificado la capacidad antioxidante como grupo funcional mediante los ensayos: ABTS (ácido 2, 2'-azino-bis -3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), DPPH (2, 2- Difenil-1-picrilhidrazilo), FRAP (poder antioxidante de reducción férrica). Como grupo de antioxidantes, los principales ensayos incluyen la determinación del contenido de fenoles totales por el método Folin-Ciocalteu. Mientras que técnicas por cromatografía líquida con detección ultravioleta se utiliza para determinar los antioxidantes individuales.

Ensayo Fenoles Totales

El análisis se realiza conforme a la reacción colorimétrica de FolinCiocalteu (Singleton and Rossi, 1965). Para determinar el contenido de fenoles totales se realizó una curva de calibración con concentraciones de 0.0094, 0.0282, 0.0564 y 0.1504 mg/L preparadas a partir de una disolución stock de ácido gálico (AG). Posteriormente, se utilizó 10 μL de extracto, 150 μL de agua destilada y 20 μL de reactivo FC. La mezcla se homogeneizó y se pre-incubó por cinco minutos. A continuación, se adicionaron 30 μL de una disolución de carbonato de sodio (140g/L), se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, protegida de la luz. Finalmente, se procedió a medir la absorbancia de la muestra a 725 nm en un espectrofotómetro UVVisible (Thermo, Multiskan).

Figura 2. Resultados de fenoles totales expresados en mgGAE/g de extracto etanólicos de cuerpos fructíferos liofilizados. Los datos representan el promedio±SEM de n=3.

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Ensayo DPPH

El método DPPH, se fundamenta en la cuantificación de la decoloración del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo, este es un radical estable de coloración violeta, el cual absorbe a 517nm. La adición de antioxidantes al radical DPPH∙ lo reduce en función de la concentración.

En una placa de 96 pocillos se añadieron 100 μL de las diferentes concentraciones de extracto (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 2, 3 y 5 mg/mL) y 150 μL de solución de DPPH∙ a 76 μM. Posteriormente se midió la DO a 517 nm en un lector de placas (MultiSkan, Thermo) con agua destilada como referencia. El antioxidante de referencia utilizado fue vitamina C en un intervalo de concentraciones de 0,05 a 1 mg/mL

La actividad secuestradora del extracto se expresa mediante el porcentaje de inhibición de la absorbancia del DPPH∙, según la ecuación: Inh DPPH• (%) = [1 - (DOmuestra/ DOref)] * 100

Figura 3. Curvas de porcentaje de inhibición de extractos etanólicos de cuerpos fructíferos del radical DPPH. Los datos representan el promedio±SEM de n=3

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Figura 4. Curvas de porcentaje de inhibición de extractos etanólicos de sustratos del radical DPPH. Los datos representan el promedio±SEM de n=3

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Ensayo FRAP

El ensayo FRAP mide la reducción de un complejo formado por un cromógeno, normalmente de TPTZ (2, 4, 6-tripiridil-s-triazina), y hierro férrico (Fe³⁺) incoloro a un complejo ferroso (Fe²⁺) de un intenso color azul verdoso en presencia de antioxidantes. TPTZ (2,4,6 tripiridyl-s-triazina), que a pH ácido (pH=3.6) se une al ión ferroso formando un compuesto de color azul que presenta un máximo de absorción a 593 nm durante 30 minutos, este color es considerado directamente relacionado con la capacidad reductora total del antioxidante y puede ser medido cuantitativamente por espectrofotometría.

En una placa de 96 pocillos se añadieron 10 μL del extracto y 240 μL del reactivo FRAP previamente incubado a 37ºC. Se incuba durante 10 min y se lee la DO a 593 nm en un lector de placas (MultiSkan Thermo). La absorbancia final de las muestras se comparó con la curva estándar de Trolox (0-5000 μmol/L) disuelto con metanol.

Figura 5. Capacidad antioxidante en equivalentes de TROLOX (TEAC) expresados en mMTROLOX/g extracto etanólicos. Los valores representan el promedio de tres repeticiones ± SEM

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Ensayo ABTS

La adición de los antioxidantes de la muestra reduce el radical ABTS^∙+. De esta manera, el grado de decoloración como porcentaje de inhibición del radical catión ABTS está determinado en función de la concentración así como del valor correspondiente usando el Trolox como estándar, bajo las mismas condiciones. El método elegido para la generación del radical es un químico, utilizando el persulfato de potasio a 70mM como oxidante. El radical se genera a partir de su precursor el ácido 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolín)-6-sulfónico (ABTS). A una concentración de 2mM. El radical ABTS^∙+ generado es un radical catiónico de color verde-azulado, estable y con un espectro de absorción en el UV-visible (734nm).

Los extractos se evaluaron a las concentraciones de 0.4, 1, 2, 3 y 5 mg/mL para poder calcular los gráficos de inhibición y calcular los EC₅₀ de TROLOX y el EC₅₀ extracto. Para posteriormente calcular el valor de TEAC (EC₅₀ de TROLOX/EC₅₀ extracto) expresados los resultados como (μmol Trolox/g extracto)

En una placa de 96 pocillos se añadieron 2.5 μL de las diferentes concentraciones de extracto y 250 μL de solución diluida del radical ABTS^∙+. Posteriormente se midió la DO a 734 nm tras 1 hora de incubación en un lector de placas (MultiSkan Thermo).

Figura 6. Curvas de porcentajes de inhibición de extractos etanólicos de cuerpos fructíferos por el radical ABTS. Valores de TEAC (μM/g extracto). Los valores corresponden a promedios de tres repeticiones independientes.

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En base a los resultados de las pruebas realizadas en cuerpos fructíferos y sustrato agotado, se confirma la presencia de antioxidantes, presentando más capacidad antioxidante los cuerpos fructíferos que los sustratos. Cabe resaltar que estos también presentan actividad antioxidante. Los datos obtenidos mediante la aplicación de los métodos DPPH y FRAP así lo constatan. Aunque no se correlaciona con el contenido de fenoles totales de los sustratos. Los rendimientos de los sustratos fueron muy menores en los sustratos que en los cuerpos fructíferos, por este motivo, los ensayos de inhibición se tuvieron que hacer a concentraciones más bajas, en el caso de los sustratos.

En cuanto a los cuerpos fructíferos, se puede concluir que los culillos de Agaricus bisporus presentan menor capacidad antioxidante, no mostrando este comportamiento en el caso del ensayo FRAP. Además, no existen diferencias entre ellos en el contenido de fenoles totales.

En el caso de comparar Agaricus bisporus y Agaricus brunnescens, en los ensayos FRAP y ABTS mostraron inhibiciones mayores en el caso de Agaricus brunnescens. Aunque su efecto de inhibición del radical DPPH presentó EC₅₀ similares para ambas especies.

Este estudio ha servido para confirmar un efecto de la capacidad antioxidante entre diferentes tipos de muestras como de métodos de aplicación en la investigación de alimentos funcionales. Se confirma que tanto los hongos como sus subproductos y hasta los sustratos presentan capacidad antioxidante y podrían ser una fuente importante de compuestos antioxidantes.

Agradecimientos

Este proyecto ha sido cofinanciado Programa Operativo FEDER de La Rioja 2014 – 2020 (Proyecto CT21_03).

BIOTEC